外泌体为细胞分泌而来的微小囊泡，直径在30-150nm之间，是细胞旁分泌的重要组成部分 [1-2]。它们参与细胞因子、mRNA、miRNA和蛋白质等生化物质的运输，因此在细胞间通讯中起着至关重要的作用[3]。
氧浓度已被公认为在MSCs的增殖、分化和自我更新过程中至关重要[4]。然而，在体外培养条件下，MSCs通常处于常氧状态，这与自然生理条件下体内的氧气浓度非常不同。事实上，很大一部分MSCs存在于体内缺氧的环境中[5]。有研究表明，在梗死心脏模型的研究中发现，缺氧处理后来源于MSCs的外泌体表现出血管化增加、心肌细胞凋亡率降低和心脏祖细胞募集增加[6]。同时，还有一项研究证明，当 MSCs 在 3D 细胞培养中呈球状培养时，与在 2D 细胞培养中分泌的外泌体相比，外泌体的产生显著增加。此时球体的中心区域是缺乏氧气和营养的，也正是因为球体内部区域的细胞团积累引起的轻度缺氧，从而增加了 MSCs 的存活率和这些细胞的分泌能力[7]。这些研究均证明了，MSCs的缺氧处理可以显著增强其生物学功能和活性，从而提高MSCs分泌外泌体的能力。
图1. 缺氧MSCs衍生外泌体对心肌梗死后心脏修复的作用和机制的示意图[6]。
本次实验通过研究人脐带来源MSCs在CEL-G® Culture Ad60固定床生物反应器（Ad60 FBR）FB-2 中的生长情况，使用相同来源的MSCs、相同培养基、相同细胞接种密度（2E4 cells/cm2），分别设置高溶氧（DO=80±10%）和低溶氧（DO=40±10%）进行培养，摸索出MSCs 在低溶氧状态下的 3D 培养工艺。相较于高溶氧状态下，低溶氧罐成功培养了25天，并收获了多达 12 批次的细胞上清液，为外泌体生产提供了更高效的技术支持。
Ad60 FBR，可提供细胞生长面积2 m2，工作体量相当于40层细胞工厂，工作体积850 mL；
人脐带来源MSCs，准备的种子细胞总量：4×108 cells/batch，即细胞接种密度为2×104 cells/cm2；
CEL-G® Culture MSC Basal SFM 完全培养基（扩增用）；CEL-G® Culture MSC ExoPro SFM 完全培养基（生产用）；
高溶氧DO=80±10%；低溶氧DO=40±10%；
高溶氧15 days；低溶氧 25 days。
Day-1进行电极校准，固定床罐体及物料瓶进行121℃ 30min高温灭菌，冷却后加入800mL培养基，参数设置：pH7.10，温度37.0℃，转速620rpm，其中高溶氧罐DO设置80%，低溶氧罐DO设置40%；
Day0制备50mL细胞悬液进行细胞接种，接种6小时取样镜检无大量游离细胞后开启外循环，外循环培养基体积700mL，循环流速10mL/min，转速500rpm；
进入细胞扩增阶段，每天取上清进行生化指标监测；
Day3起每隔48h收获罐内外上清并更换1L新鲜培养基进行循环；
将收获的细胞上清原液进行NTA检测，并进行溶氧状态对外泌体表达情况的比较。
在细胞接种后每天取样进行葡萄糖、乳酸及LDH的相关代谢浓度统计。统计结果显示，低溶氧罐（L-DO组）较高溶氧罐（H-DO组）中细胞代谢更为活跃，证明细胞生长状态良好。具体生化代谢浓度统计数据对比如下：
图2. MSCs在Ad60 FBR 上高溶氧（H-DO）及低溶氧（L-DO）条件下生化代谢浓度对比曲线：(A)葡萄糖代谢趋势; (B)乳酸代谢趋势; (C)LDH 代谢趋势。
收获阶段，分别从Day3起每隔48h进行细胞上清原液的全收获。低溶氧罐的培养周期从15days延长至 25days，收获批次从高溶氧罐收获7批次上清液延长至收获12批次上清液，且各批次外泌体产量均能稳定达到1×1014 particles 以上。具体各批次收获的外泌体检测数据对比如下：
图3. MSCs在Ad60 FBR上高溶氧（H-DO）及低溶氧（L-DO）条件下外泌体收获检测数据：(A)多批次收获外泌体总产量; (B)多批次收获外泌体累计总产量。
经评估，Ad60 FBR 2m2 高溶氧罐最终培养15days，收获外泌体总体积7.5L，得到外泌体总产量为1.12E15 particles。低溶氧罐最终培养25days，收获外泌体总体积12.5L，得到外泌体总产量为2.18E15 particles。此次研究证明了，低溶氧条件可显著提高细胞代谢水平，延长培养时间、增加外泌体收获批次，从而提高总产量。此次实验的外泌体产量也得到了喜人的结果，为后续MSC进行更大规模的培养及外泌体收获提供了数据支撑。
CEL-G® Culture Ad60系列
固定床生物反应器（Ad60 FBR）介绍
Ad60 FBR由同腾新创（苏州）科技有限公司自研，反应器由一个不锈钢罐体培养容器与控制主机构成，培养罐体内采用PET膜材为细胞生长提供3D微环境，具有独特的瀑布流设计，让固定床具备更小的剪切力，提供更加亲和的细胞培养环境，控制主机体型较小可以放入生物安全柜进行无菌合规操作。Ad60 FBR能够提供从1m2至60m2的细胞培养面积，可实现从工艺参数的开发到中试验证再到GMP生产的线性放大，可应用于细胞和基因治疗、溶瘤病毒、干细胞/外泌体生产和疫苗等领域。
图4. CEL-G® Culture Ad60 系列固定床生物反应器
CEL-G® Culture MSC 无血清培养基介绍
同腾新创自主研发的CEL-G® Culture MSC 培养基系列，目前主要有以下两款产品。一款是CEL-G® Culture MSC Basal SFM间充质干细胞无血清基础培养基，适用于多种来源的间充质干细胞原代分离培养、以及传代扩增培养；Basal培养基支持MSC稳定传代至15代。另一款是CEL-G® Culture MSC ExoPro SFM间充质干细胞外泌体生产无血清培养基，适用于间充质干细胞外泌体生产的细胞扩增阶段、以及收获阶段；ExoPro培养基支持MSC 2D、3D细胞培养收获外泌体。CEL-G® Culture MSC 无血清培养基为MSC的培养及干细胞制剂的研发提供了科学的保障。
图5. CEL-G® Culture MSC 无血清培养基
